Profil molekularny nowotworu określa cechy genetyczne guza, czyli wskazuje specyficzne zmiany mające znaczenie dla rozwoju choroby oraz jej leczenia. Do określenia tych cech wykorzystywane są biomarkery nowotworowe.

W komórkach nowotworowych oznacza się różnego typu biomarkery, odnoszące się do genów lub białek. Niektóre biomarkery informują o agresywności nowotworu i określają rokowanie dla pacjenta, inne wskazują na obecność lub brak cech mających związek z oddziaływaniem leków.

Aby poznać profil molekularny guza wykorzystuje się różnorodne techniki badawcze z zakresu biologii molekularnej. Podstawowymi badaniami są analizy zmian genów związanych z procesem nowotworzenia (techniki NGS, PCR, PyroSeq, sekwencjonowanie Sangera). Badania zmian tylko w obrębie genów nie niosą pełnej informacji o działaniu szlaków molekularnych w komórkach nowotworowych, mających ogromne znaczenie dla rozwoju guza i leczenia.

Dlatego kompleksowy i szeroki profil obejmuje również biomarkery białkowe (techniki IHC, FISH/CISH), obrazujące obecność, brak lub aktywność poszczególnych białek w guzie.

Oznaczone w trakcie profilowania molekularnego biomarkery wiąże się z systematycznie aktualizowaną bazą informacji klinicznych, dotyczącą ich związku z oddziaływaniem leków, co umożliwia ustalenie najlepszej terapii. Dzięki profilowaniu molekularnemu wskazane zostaną leki, które w danym nowotworze mogą przynieść potencjalny efekt terapeutyczny, te które prawdopodobnie nie będą skuteczne, oraz niosące duże ryzyko działania niepożądanego.

Zalety profilowania molekularnego:  

• wskazanie leków, które mogą przynieść potencjalne korzyści kliniczne, co umożliwia ustalenie optymalnego leczenia
• określenie terapii, które nie były wcześniej brane pod uwagę
• wykrywanie leków z potencjalnym brakiem korzyści (co pomaga uniknąć ich niepotrzebnego podawania i nie naraża pacjentów na skutki toksyczności tych leków)
• dopasowanie odpowiednich badań klinicznych do pacjentów

Technologie

Profilowanie molekularne nowotworów wykorzystuje najnowocześniejsze technologie biologii molekularnej na poziomie DNA i RNA oraz markerów białkowych.

Sekwencjonowanie kwasów nukleinowych:

Sekwencjonowanie DNA i RNA jest to technika odczytywania sekwencji (kolejności ułożenia) kolejnych nukleotydów, czyli składowych części budujących DNA oraz RNA. Porównanie sekwencji w tkance guza ze znanymi sekwencjami występującymi w zdrowych, niezmienionych komórkach, umożliwia odnalezienie zmian w komórkach nowotworowych.

Sekwencjonowanie DNA pozwala na wykrycie mutacji, natomiast RNA pozwala na rozpoznanie nieprawidłowego łączenia się fragmentów genów (fuzji genów) oraz błędnego połączenia części kodujących genów (splicing).

W profilowaniu molekularnym sekwencjonowanie DNA wykonywane jest różnymi technikami.

1. NGS – Sekwencjonowanie Następnej Generacji

NGS jest jedną z najnowocześniejszych technik biologii molekularnej. Umożliwia jednoczesne badanie zmian nawet w setkach genów. Technika NGS wykorzystywana jest między innymi do analizy obecności mutacji w genach, badania liczby kopii genów (nieprawidłowej ilości), insercji, delecji oraz rearanżacji genów. Sekwencjonowanie NGS podzielone jest na kilka etapów, które obejmują przygotowanie próbek DNA i RNA (izolację i tworzenie bibliotek, zawierających określone fragmenty DNA/RNA, tzw. matryce), namnażanie matryc, równoległe sekwencjonowanie wielu matryc DNA lub RNA oraz analizę danych.

2. Sekwencjonowanie Sangera

Jest to jeden ze sposobów sekwencjonowania DNA polegający na terminacji (zakończeniu) łańcucha DNA poprzez przyłączenie nukleotydów hamujących dalsze wydłużanie nici. Wykorzystywane jest do identyfikacji mutacji lub potwierdzania ich występowania, jeżeli zostały wykryte w genach innymi metodami.

3. PyroSeq – pirosekwencjonowanie

Pirosekwencjonowanie jest kolejną metodą sekwencjonowania DNA, bazującą na sekwencjonowaniu przez syntezę. Różni się ono od sekwencjonowania Sangera, ponieważ opiera się na wykrywaniu przyłączania nukleotydów. Metoda ta wykrywa obecność mutacji w genach, potwierdza ich obecność, a także bada modyfikacje DNA, np. metylację, która bezpośrednio wpływa na aktywność genów.

PCR – Reakcja Łańcuchowa Polimerazy

PCR jest techniką umożliwiającą otrzymywanie dużej liczby kopii fragmentów DNA, w którym znajduje się gen lub geny poddane późniejszej analizie. Materiałem do namnażania (amplifikacji) jest DNA wyizolowany z krwi lub próbki guza (biopsja, tkanka pooperacyjna). Dalsze badania, np. sekwencjonowanie, wskaże czy w sekwencji genu/genów są obecne błędy (mutacje).

IHC – barwienie immunohistochemiczne

IHC (barwienie immunohistochemiczne) jest badaniem obrazującym występowanie biomarkerów białkowych w materiale pobranym z guza. Białka są produktami genów, dlatego w profilowaniu ważna jest również ich analiza, ponieważ zmiany w genach mogą prowadzić do powstawania nieprawidłowych białek, zaburzeń ich funkcji, lub też braku ich występowania.

Do wykrywania poszczególnych białek wykorzystywane są specjalnie znakowane przeciwciała, które wiążą się wyłącznie ze specyficznymi białkami. Jeżeli badane białka występują w komórkach nowotworowych, tworzone są kompleksy białko-przeciwciało, a obecność tych kompleksów stwierdza się podczas analizy mikroskopowej. Dzięki temu określa się tzw. immunofenotyp nowotworu, który informuje o występowaniu konkretnych białek w komórkach nowotworowych oraz pozwala na ocenę aktywności szlaków, w których biorą udział.

Kompleksowe oznaczanie markerów białkowych wraz z sekwencjonowaniem NGS ma ogromne znaczenie w doborze terapii. Ilość informacji o skuteczności działania leków, powiązana zarówno z biomarkerami białkowymi i genetycznymi, jest znacznie większa od liczby danych bazujących wyłącznie na sekwencjonowaniu i analizie mutacji w genach (NGS).   

FISH/CISH (Fluorescence/Chromogenic In Situ Hybrydyzation)

FISH/CISH (Fluorescencyjna/Chromogeniczna hybrydyzacja in situ) są technikami cytogenetycznymi służącymi do wykrywania określonej sekwencji DNA w materiale genetycznym. Detekcja sekwencji następuje przy użyciu specjalnych sond, połączonych z barwnikami (różnią się one w zależności od metody hybrydyzacji). Podczas badania mikroskopowego, na preparatach przygotowanych z tkanki nowotworowej, sondy łączą się tylko z określonymi fragmentami DNA, a dzięki barwnikom możliwe jest zlokalizowanie miejsca ich wiązania (hybrydyzacji) i analiza. FISH/CISH umożliwia wykrycie delecji (nieobecności genu/fragmentu genu), liczby kopii genu, translokacji (zmiany położenia) oraz fuzji (połączenia genów). Określenie tych zmian ma ogromne znaczenie w doborze odpowiedniej terapii przeciwnowotworowej.